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糖尿病脑梗死大鼠血管内皮生长因子及其受体表达水平的变化

徐晓云 李刚

摘 要:

目的研究糖尿病脑梗死(DMCI)早期半暗带等值区血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(FLT-1,FLK-1)表达水平的变化。方法建立DMCI大鼠模型,在脑缺血后1h、3h、6h、12h、24h,采用原位杂交方法测定大鼠大脑缺血半暗带等值区VEGF、FLT-1、FLK-1mRNA的表达水平;并与无糖尿病的脑梗死(NDMCI)大鼠比较。结果DMCI组在脑缺血后各时间点脑缺血半暗带等值区VEGFmRNA的表达水平均显著低于NDMCI组(P〈0.05~0.01),FLK-1mRNA表达水平在脑缺血后12h显著低于NDMCI组(P〈0.01),FLT-1mRNA表达水平在脑缺血后各时间点(除6h)与NDMCI组差异无统计学意义。结论DMCI早期VEGF和FLK-1mRNA表达水平降低,这可能是DMCI血管、神经病变重的原因之一。

作者单位:200120上海,同济大学附属东方医院神经内科

【摘要】    目的 研究糖尿病脑梗死(dmci)早期半暗带等值区血管内皮生长因子(vegf)及其受体(flt1,flk1 )表达水平的变化。方法 建立dmci大鼠模型,在脑缺血后1 h、3 h、6 h、12 h、24 h,采用原位杂交方法测定大鼠大脑缺血半暗带等值区vegf、flt1、flk1 mrna的表达水平;并与无糖尿病的脑梗死(ndmci)大鼠比较。结果 dmci组在脑缺血后各时间点脑缺血半暗带等值区vegf mrna的表达水平均显著低于ndmci组(p<0.05~0.01),flk1 mrna 表达水平在脑缺血后12 h显著低于ndmci组(p<0.01),flt1 mrna 表达水平在脑缺血后各时间点(除6 h)与ndmci组差异无统计学意义。结论 dmci早期vegf和flk1 mrna表达水平降低,这可能是dmci血管、神经病变重的原因之一。

【关键词】  糖尿病 脑梗死 血管内皮生长因子 flt1 flk1

  changes of expression levels of vascular endothelial growth factor and its receptors in diabetes rats with cerebral infarction 

  xu xiaoyun, li gang.

  department of neurology, east hospital, tongji university, shanghai 200120, china
   
  abstract:objective  to study the changes of expression levels of vascular endothelial growth factor(vegf) and its receptors (flt1,flk1) mrna in equal area of penumbra in diabetes rats with cerebral infarction(dmci). methods  middle cerebral artery occlusion (maco) model was made in diabetes rats. the expression levels of vegf and flt1,flk1 mrna in equal area of penumbra were measured with situ hybridization in different times after maco (1 h,3 h,6 h,12 h,24 h). the difference was compared between dmci group and no diabetes cerebral infarction (ndmci) group. results  the expression level of vegf mrna was lower in dmci group than that of ndmci group at every time point (p<0.05 ~ 0.01). the expression level of flk1 mrna was lower (p<0.01) at 12 h after maco in dmci group than that in ndmci group. except for at 6 h, there was no significant difference between dmci and ndmci group in the expression level of flt1 mrna. conclusion   the expression levels of vegf and flk1 mrna are reduction in dmci early period, which may be partly responsible for poor prognosis in diabetes mellitus cerebral infarction.
   
  key words:diabetes; cerebral infarction; vascular endothelial growth factor; flt1;flk1

  血管内皮生长因子(vegf)及其受体(flt1,flk1)是脑缺血后血管形成、神经保护和脑水肿的关键生物因子。在糖尿病慢性缺血性病变中,vegf在缺氧因素刺激下常反应性增高。而其在急性糖尿病性脑缺血病变时的表达水平变化未见报道。为此,本研究选择对脑梗死治疗及预后具有决定性影响的缺血半暗带为目标区域,观察糖尿病脑梗死(dmci)后vegf及flt1、flk1 mrna表达水平的变化,以期为临床应用提供实验依据。

  1  材料与方法

  1.1  动物与分组  清洁级sd大鼠40只,雌雄不拘,质量200~250 g,由中国科学院上海分院动物部提供。随机分为dmci组与无糖尿病的脑梗死(ndmci)组,每组20只,再分为脑缺血后1 h、3 h、6 h、12 h、24 h 5个亚组,每亚组4只大鼠。

  1.2  方法

  1.2.1  糖尿病大鼠模型制作  dmci组大鼠禁食12 h后,腹腔内注射链脲佐菌素(溶于0.1 mol/l ph 4.2的柠檬酸缓冲液,新鲜配制) 55 mg/kg。5 d后,大鼠出现多饮、多食、多尿,1周后测空腹血糖>16.7 mmol/l者为糖尿病模型;连续高脂饮食饲养6周。

  1.2.2  脑梗死大鼠模型制作  参照koizumi和zea longa线栓法制作大脑中动脉阻塞(maco)模型。将两组大鼠用水合氯醛腹腔注射麻醉后仰卧位固定,颈正中切口,分离、结扎右侧颈总、翼额、颈外动脉。在颈总动脉分叉处近端剪开一小口,用0.25 mm尼龙线插入颈内动脉约17 mm,遇轻微阻力后阻塞大脑中动脉起始处,线栓固定。术中及麻醉期间小电热毯维持动物直肠温度36.5~37℃,注意观察呼吸及心率变化。

  1.2.3  组织取材  在预定时间麻醉各亚组大鼠后,经左心室快速灌注生理盐水150 ml冲洗血管,然后以1.5%戊二醛、4%多聚甲醛 250 ml缓慢灌流1 h。参照文献[1]报道的方法,采用组间等位定位法设定半暗带的等值区。低温剥取右侧大脑距离嗅球尖端7~11 mm之间、大脑矢状裂至外侧裂上1/3皮质组织块。

  1.2.4  vegf、flt1、flk1 mrna的表达水平检测(1)探针制备:根据ncbi公布的sd大鼠vegf、flt1及flk1的序列设计引物,并以sd大鼠正常脑组织cdna为模板进行pcr扩增,产物经测序验证正确后,采用pcr产物回收试剂盒进行纯化;采用roche公司dna标记和检测试剂盒ⅰ对pcr产物进行地高辛标记得到相应的探针。按照以下引物序列扩增探针,各引物序列为:vegf:f 5′tgc act gga ccc tgg ctt tac3′,r 5′cgg caa tag ctg cgc tgg tag3′;flt1:f 5′ttt tgt ttg ttg tcg ctg tt3′,r 5′tcg ttt gct gtt ctc cct3′;flk1:f 5′gtg aag cca tca aca aag3′,r5′tgg aat gcc aca atc aag3′。(2)杂交方法:组织块迅速经depc处理的4%多聚甲醛进行后固定,常规脱水、透明、石蜡包埋,连续切片,厚度5~8 μm,粘片,脱蜡。蛋白酶k(200 μm/ml)处理,37℃ 30 min,trisglycine漂洗终止反应,4%多聚甲醛4℃平衡5 min后,2×scc漂洗15 min,每张切片滴加杂交液进行预杂交2 h,移去杂交液,滴加含有探针的杂交液,并以不含探针的杂交液作为对照,42℃ 杂交过夜。用scc进行充分的漂洗,最后加适量的氮蓝四唑/溴氯吲哚磷酸盐(nbt/bcip),避光室温显色,显微镜观察显色情况。待显色充分后用5×te终止反应,封片。(3)图像分析:采用leica q wc图像分析系统,放大200倍输入图像,采用相同参照测定相对灰度值作为表达水平。

  1.2.5  统计学方法  检测数据以均数±标准差(±s表示),用spss 10.0 软件进行t检验。

  2  结果
   
  dmci组与ndmci组大鼠均发现vegf mrna在神经元、胶质细胞中有表达,而flt1与flk1 mrna 表达于血管内皮细胞。两组vegf、flt1、flk1 mrna表达水平的动态变化见表1。dmci组vegf mrna表达在缺血后24 h内均处于较低水平。ndmci组vegf mrna表达水平在缺血后3 h开始升高,至12 h达到高峰,而后下降;flt1与flk1 mrna表达在缺血后24 h内均处于较低水平。两组flk1 mrna表达水平的趋势不同:ndmci组逐渐增加,dmci组逐渐下降,但至脑缺血后24 h dmci组再次升高。 ......(未完,请点击下方“在线阅读”)

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